胰腺癌(PDA)是一种致命的恶性肿瘤，5年生存率为11%。由于胰腺癌中存在广泛的肿瘤微环境(TME），即便使用最为新的免疫疗法，患者的最终治愈率依然低下。先前的报道显示，胰导管腺癌的发生与WNT信号的激活有关，但是信号通路的激活与肿瘤微环境之间的调控关系尚不清楚。来自美国密歇根大学的研究团队在Journal of Experimental Medicine（IF 17.579）上发表题为“WNT signaling in the tumor microenvironment promotes immunosuppression in murine pancreatic cancer”的文章。该文章应用单细胞转录组测序技术对胰腺癌样本进行检测，系统的解析了表达Tcf7的CD4+T细胞通过调控肿瘤微环境的改变，引起PD-L1+细胞的代偿性增加。然后，作者在动物模型中，使用WNT信号抑制剂联合靶向PD-L1治疗方案，成功降低了胰腺癌的生长。这一研究成果也为临床治疗胰腺癌提供了新的指导方案。
研究材料
16个样本的PDA患者单细胞转录组数据集（PDA组织和配对的血液样本）
3个样本的小鼠的单细胞转录组（组织样本）
技术路线
步骤1：单细胞转录组验证了Tcf7在人和小鼠PDA的CD4+ T细胞中的保守性；
步骤2：敲除Tcf7可以通过抑制CD4+T细胞的免疫功能改变肿瘤微环境；
步骤3：敲除Tcf7可以调控PD-L1+髓细胞细胞代偿性的增加;
步骤4：实验验证了抑制WNT信号通路对PDA的治疗效果。
研究结果
1. 单细胞转录组验证了Tcf7在人和小鼠PDA的CD4+ T细胞中的保守性
为了了解WNT通路在胰腺中的表达情况，作者选择了课题组先前发表的临床PDA组织的单细胞数据集进行分析。然后在单细胞的结果上展示了WNT通路中基因的表达水平，结果显示Tcf7基因（编码TCF1蛋白）在CD4+T细胞中表达量最高。并且在这16个PDA患者配对的PBMC样本中展示出了同样的现象。为了确定Tcf7的表达模式具有物种保守性，作者又选择了3只小鼠（healthy=2，mPDA=1）进行单细胞测序，通过数据分析共鉴定出了15种细胞类型。进一步分析显示，相比较健康的小鼠，Tcf7基因在mPDA模型CD4+T细胞中表达的水平更高。这一结果与患者样本的单细胞数据结果相吻合。
图1 Tcf7在人和小鼠PDA的CD4+ T细胞中普遍存在 2. 敲除Tcf7可以通过抑制CD4+T细胞的免疫功能改变肿瘤微环境
TCF1最初被认为是T淋巴细胞特异性转录因子，在T细胞的发育和分化中起着关键作用。因此，基于单细胞的数据分析结果，作者设想TCF1在PDA中具有调节CD4+ T细胞的免疫抑制功能。接下来，作者设计了Tcf7敲除模型。经过一段时间培养后，发现敲除小鼠的肿瘤生长显著降低。通过IHC和流式分选等实验进一步验证了CD4+ T细胞的免疫抑制功能可能由TCF1介导。上述的实验结果显示出了Tcf7在调控CD4+T细胞改变肿瘤微环境的重要作用。
图2 CD4+ T细胞中的TCF1信号通路介导其免疫抑制潜能
接下来，作者设计了对应的Tcf7敲除模型小鼠进行单细胞测序。分析结果显示Tcf7在CD4+T细胞中的表达水平最高。为了探索Tcf7失活后T细胞的变化，作者对Cd3e表达细胞进行了亚群再聚类分析，并确定了11个不同的cluster。进一步的比较分析显示了在Tcf7缺失模型组中，Treg细胞显著减少，而Th17细胞显著增加。随后，作者通过实验验证了这一结论，从而，揭示了Tcf7的失活抑制Treg细胞分化，促进Th17细胞分化的作用。
图3 CD4+ T细胞中的TCF1信号通路促进PDA中的Treg分化
图3 CD4+ T细胞中的TCF1信号通路促进PDA中的Treg分化 3. 敲除Tcf7可以调控PD-L1+髓细胞细胞代偿性的增加
接下来，为了确定CD4+ T细胞中Tcf7的失活是否改变了PDA TME中髓系细胞的组成，作者对髓系细胞进行了亚群再聚类，共鉴定出6种细胞类型，发现不同的细胞在两组模型中的变化显著。然后作者研究了髓系细胞免疫抑制的潜力，然而不同的髓系细胞亚群在两组间的Cd274(PD-L1)表达水平相似，但是Arg1和Nos2的表达水平在敲除组中更高。这些结果提示了敲除Tcf7导致了免疫抑制表型增强。这一结果与作者之前观测到的结果相吻合。随后，作者通过质谱流(CyTOF)技术再次验证了这一结果，同时发现在CyTOF的结果中，Tcf7敲除组的PD-L1的髓系细胞数量增加。因此，作者推测PD-L1+细胞的增加是否可以作为治疗胰腺癌的靶点。
图4 CD4+ T细胞中TCF1的缺失导致MDSCs的代偿性增加先前的报道显示，在一些肿瘤中存在IL-17与PD-L1的表达相关。因此，作者在骨髓来源的髓系前体细胞(BMDMs)上测试了IL-17是否调节PD-L1的表达。结果发现，IL-17A会导致Cd274、Arg1和Nos2的高表达。然而这一结果却没能在PDA模型的细胞系中重现。随后，作者设计了细胞共培养实验，证实了TCF1缺失的CD4+ T细胞能够诱导肿瘤细胞中PD-L1的表达。
图5 CD4+ T细胞中TCF1的缺失驱动髓细胞和肿瘤细胞中PD-L1的表达 4. 实验验证了抑制WNT信号对PDA的治疗效果
作者先前的数据表明了WNT通路在上皮细胞中参与对肿瘤的支持作用。作者设计使用能够抑制WNT信号通路的PORCN抑制剂(PORCNi)，将小鼠随机分为对照组或PORCNi组。结果发现PORCNi治疗后的小鼠肿瘤更小。然后，作者通过流式细胞术评估了WNT信号的抑制作用是否改变了肿瘤的微环境。结果观察到在PORCNi治疗后的小鼠中Total T细胞和CD8+ T细胞浸润的增加。随后，作者又通过抗CD8和抗PD-L1进行功能验证，发现抑制WNT信号可以使PDA对PD-L1阻断敏感，表明联合靶向可以降低胰腺癌的生长，并可能有益于胰腺癌的治疗。
图6 抑制WNT信号可以提高了PD-L1阻断的疗效小编小结
作者在先前大量的研究中报道了WNT信号在上皮细胞和CD4+ T细胞中具有活性，并有助于阻断CD8+ T细胞的抗肿瘤活性。因此，在本次研究内容中，作者采用单细胞转录组测序技术对PDA患者和模型小鼠的胰腺癌肿瘤组织进行检测，详细的描述了CD4+ T细胞中Tcf7的失活以特异性的方式抑制WNT信号，从而激活 CD8+ T细胞效应功能来抑制肿瘤进展。但是表达PD-L1的肿瘤细胞和髓系细胞的数量也得到代偿性增加。通过药物抑制在肿瘤细胞和CD4+ T细胞中抑制WNT信号，联合PD-L1治疗可以有效抑制肿瘤生长。这一研究成果或许可以为胰腺癌的临床治疗提供新的解决方案。
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