糖基化修饰是蛋白质中最普遍的翻译后修饰，在调节生理和病理过程中发挥着非常重要的作用。近年来，基于质谱的定量糖蛋白组学阐明了糖基化修饰/糖蛋白在生理和病理过程中的作用，并逐渐成为一种筛选潜在生物标志物的重要方法。然而由于复杂样品中糖肽的浓度比较低、糖链组成非常复杂等原因，对于完整N-糖肽的定性定量分析仍然存在着一定的难度。肝脏疾病是困扰我国人群的主要疾病之一，亟需筛选生物标志物用于早期的临床检测和诊断。

2022年4月，复旦大学生物医学研究院陆豪杰教授团队在National Science Review（IF 17.275）发表了一篇题为“High-throughput site-specific N-glycoproteomics reveals glyco-signatures for liver disease diagnosis”的研究文章，该文中提出了一种高通量完整N-糖肽定量的研究方法（HTiGQs），并利用完整N-糖肽方法分析筛选了不同肝脏疾病的生物标志物、采用PRM的方式验证了肝脏疾病不同阶段的糖基化表达的变化。

研究材料：
肝脏疾病患者和健康对照的血清


技术路线：
步骤1：HTiGQs增强了完整N-糖肽的鉴定和定量；
步骤2：大规模血清糖蛋白组学的表征；
步骤3：肝脏疾病生物标志物的筛选。


研究结果：
1. HTiGQs增强了完整N-糖肽的鉴定
作者的研究路线如图1所示，首先利用10-plex TMT进行糖肽标记，随后在HCD和ETD-MS/MS模式下，加入DMEN进一步标记N-糖肽。待验证标记成功后，作者比较了有标记和没有标记的N-糖肽的鉴定结果，研究发现标记后鉴定到的N-糖肽数量是未标记的三倍（图2a）且肽谱匹配得分更可靠(图2b), ETD-MSMS的鉴定数量较HC模式下更多（图2c）,且DMEN标记显著增加了糖肽的电荷数（图2d-2e），进而提高了ETD-MS/MS模式下对完整N-糖肽检测的可靠度（图2f）。

图1 完整N-糖肽分析鉴定和定量流程

图2 HTiGQs对完整N-糖肽的鉴定能力

2. HTiGQs增强了完整N-糖肽的定量

虽然TMT标记提高了单个实验的通量，但结果发现TMT标记后的糖肽的报告离子强度较低，因此为了平衡报告离子强度和识别的糖肽数量之间的关系，作者研究了不同HCD碰撞能和ETD触发获取方法的组合（图3a），结果发现sceHCD-pd-ETD 50±10的方法对于完整N-糖肽的鉴定和定量是最优的采集方法（图3b-3c）。作者进一步用IgG标品验证HTiGQs的动态范围和准确度，结果证实了HTiGQs对于完整N-糖肽定量的准确性（图3d-3f）。

图3 HTiGQs鉴定能力和准确性的分析

3. 大规模血清糖蛋白组学的表征

为了测试HTiGQs对复杂生物样本糖基化分析的适用性，作者使用HTiGQs方法对人血清中的糖蛋白组进行了研究。结果发现与非标记完整N-糖肽相比，标记后完整N-糖肽的数量增加了75%以上(图4a)。使用HTiGQs方法鉴定到N-糖基化修饰位点的motif分析结果与已知的N糖基化位点序列一致（N-X-S/T）(图4c)。随后作者对鉴定到的N糖基化蛋白进行了GO富集分析（图4d）、糖型分析（图4e）、糖蛋白-糖链网络图（图4f）、糖链共现网络图（图4g）,结果表明：岩藻糖化和唾液酸化是血清中最常见的糖基化类型、血清糖蛋白高度复杂的异质性（多个蛋白含有5个或更多的糖基化位点）、岩藻糖化的聚糖经常同时发生且它们还与其他几个复杂的和唾液酸化的聚糖群同时发生。综上所述，HTiGQs能够在复杂的生物样本(如血清)中大规模表征完整N-糖肽。

图4 人血清完整N-糖肽的表征分析

4. 肝脏疾病生物标志物的筛选

已知免疫球蛋白IgG的N-糖基化与疾病的发病机制和进展密切有关。本研究中作者分析了90例不同严重程度的人类肝病患者（慢性HBV感染、CIR（肝硬化）和HCC（肝细胞癌））和健康对照（HC）的血清中IgG 完整N-糖肽的变化，确定与某些肝脏疾病相关的特异性糖肽生物标志物。

此次研究总共鉴定到313个IgG完整N-糖肽。通过显著差异比较分析筛选后，作者选择27个显著差异糖肽（图5d）作为生物标志物的分析。研究发现糖肽IgG1-H3N5F1和IgG1-H3N4F1可以将HCC组和HC组区分开来，IgG2-H6N3F1可用于区分HBV和CIR（图5f）。多个糖肽的联合：IgG1-H3N5F1和IgG4-H4N3可以有效区分HBV、CIR和HCC组和HC组（图5g）。

随后，作者在34例肝病血清和11例健康对照中使用PRM方法验证了肝脏疾病不同阶段之间的糖基化表达变化。结果表明IgG1-H3N5F1可以有效区分HCC和HC组（图6）。

图5 肝脏疾病生物标志物的筛选

图6 糖蛋白生物标志物的PRM验证

小编小结
作者提出了一种高通量完整N-糖肽定量的研究方法，并通过对90例不同严重程度的人类肝病患者和健康对照的血清分析，发现IgG1-H3N5F1和IgG4-H4N3联合应用可用于区分不同阶段的肝病。最后，使用PRM方法验证了不同队列样本中肝脏疾病糖基化表达的变化。​​​​​​​​​​​​​​