杨宝峰院士团队RNA修饰又一成果 | 云序ac4C acRIP-seq助力揭示心脏I/R损伤的作用机制-技术前沿-资讯-生物在线
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杨宝峰院士团队RNA修饰又一成果 | 云序ac4C acRIP-seq助力揭示心脏I/R损伤的作用机制

作者：上海云序生物科技有限公司 2024-12-03T00:00 (访问量:209)

导语

急性心肌梗死（AMI）是世界范围内发病率和死亡率的主要原因。及时冠脉血液再灌注是限制心肌梗死、维持心功能的最有效治疗方法。然而，再灌注往往会加重心脏损伤，这种现象被称为缺血再灌注（I/R）损伤。尽管已经对其潜在的分子机制进行了大量的研究，但临床上减轻心脏I/R损伤的可行治疗靶点仍然缺乏。云序生物acRIP-seq助力哈尔滨医科大学杨宝峰院士团队在Redox Biology期刊（IF=10.7）发表题为“The positive feedback loop of the NAT10/Mybbp1a/p53 axis promotes cardiomyocyte ferroptosis to exacerbate cardiac I/R injury”的研究论文。这是继上期该队团在Advanced science期刊(IF=14.3)发表题为“The m7G Methyltransferase Mettl1 Drives Cardiac Hypertrophy by Regulating SRSF9-Mediated Splicing of NFATc4”的m7G修饰研究后，该课题组又一个RNA修饰（ac4c）研究。在本研究中，作者发现I/R诱导的NAT10上调是由p53以转录依赖的方式调控的。使用功能获得和功能丧失策略，作者确定了NAT10的促铁效应是心脏I/R损伤的主要触发因素。NAT10通过引起Mybbp1a mRNA的ac4C修饰增强了其稳定性，从而导致p53的激活，进而抑制抗铁沉基因SLC7A11的转录。这些发现表明，靶向NAT10/Mybbp1a/p53轴是治疗心脏I/R损伤的一个有希望的新方向。本次研究中，云序生物有幸提供了ac4C acRIP-seq，RNA-seq以及生信分析。

标题：The positive feedback loop of the NAT10/Mybbp1a/p53 axis promotes cardiomyocyte ferroptosis to exacerbate cardiac I/R injury
发表时间：2024.4.2
发表期刊：Redox Biology
样品类型：小鼠心脏组织
研究方法：ac4C acRIP-seq，RNA-seq等
 

研究摘要

铁死亡是一种非凋亡的细胞死亡形式，在心脏缺血再灌注（I/R）损伤中起核心作用。N-乙酰转移酶10（NAT10）作为一种RNA ac4c乙酰转移酶参与心肌细胞凋亡，但其在I/R损伤中心肌细胞铁死亡中的作用尚未确定。本研究旨在阐明NAT10在心肌铁死亡中的作用及其机制。在I/R小鼠心脏和缺氧/再氧化心肌细胞中，NAT10 mRNA和蛋白水平升高。在I/R过程中，p53以转录依赖的方式作为内源性NAT10激活因子。过表达NAT10可引起心肌细胞上铁血症加重I/R损伤，而心肌细胞特异性敲除NAT10或用重塑蛋白药理抑制NAT10则具有相反的作用。在机制上，NAT10诱导Mybbp1a的ac4C修饰，增加其稳定性，进而激活p53，随后抑制抗铁沉基因SLC7A11的转录。此外，Mybbp1a的下调部分消除了NAT10过表达对心肌细胞铁死亡和心脏I/R损伤的有害影响。总的来说，本研究揭示了p53和NAT10相互依赖地合作形成一个正反馈回路，促进心肌细胞铁死亡，加剧心脏I/R损伤，这表明靶向NAT10/Mybbp1a/p53轴可能是治疗心脏I/R的新方法。

技术路线

研究结果

1.p53在I/R期间转录激活NAT10
虽然有研究报道NAT10参与体外心肌细胞凋亡，但在心脏I/R过程中NAT10是否发生改变尚不清楚。为此，本研究建立了小鼠体内I/R模型和体外H/R刺激诱导的氧化应激细胞模型。WB和qPCR显示，在I/R暴露的心脏和H/R暴露的心肌细胞中，NAT10的mRNA和蛋白水平均显著升高（图1 A-B）；并且这些影响伴随着总RNA的ac4C水平的显著增加。与这些发现一致，从I/R暴露心脏梗死边界区分离的成年小鼠心肌细胞中，NAT10蛋白水平升高。据报道，在p53缺乏的细胞中，DNA损伤导致的NAT10上调被取消，这表明p53可能作为NAT10的调节剂。接下来，本研究绘制了NAT10的启动子区域，并根据JASPAR数据库发现NAT10具有潜在的p53结合基序。这些发现促使本研究探究p53是否是NAT10的上游激活因子。为了验证这一假设，本研究构建了含有NAT10启动子序列的荧光素酶报告质粒和作为阴性对照的空载质粒，并将其转染到HEK293细胞中。荧光素酶报告基因检测显示，p53激活了NAT10启动子，荧光素酶活性增加（图1 C）。此外，染色质免疫沉淀（ChIP）实验显示，p53过表达后，在p53沉淀的心肌细胞片段中，NAT10启动子区域明显富集（图1 D），这表明p53直接与NAT10启动子区域结合。进一步研究结果显示，p53 siRNA处理降低了常氧暴露和H/R暴露心肌细胞中p53的表达，这种下调导致H/R后NAT10 mRNA和蛋白水平显著降低（图1 E）。相反，与转染p53-NC的心肌细胞相比，心肌细胞中过表达p53可显著提高NAT10 mRNA和蛋白水平（图1 F-G）。然后，本实验通过尾静脉注射携带p53 shRNA的腺相关病毒9 (AAV9-shp53)，在体内敲除p53。发现与体外实验结果一致，在体内敲低p53可显著降低I/R诱导的NAT10 mRNA和蛋白水平上调（图1 H）。综上所述，这些结果表明p53可以在I/R损伤期间诱导NAT10转录。
图1：p53转录激活I/R手术期间的NAT10。
（A）qRT-PCR分析缺血再灌注和心脏模拟手术中NAT10 mRNA水平；
（B）WB分析I/R和心脏模拟手术中NAT10蛋白水平；
（C）荧光素酶检测HEK293细胞中激活NAT10启动子的p53质粒；
（D）p53与NAT10启动子结合的ChIP分析；
（E）WB检测H/R感染心肌细胞中NAT10蛋白水平；
（F）qRT-PCR分析p53质粒心肌细胞中NAT10 mRNA水平；
（G）WB检测p53过表达感染心肌细胞中NAT10蛋白水平；
（H）WB检测p53小鼠体内敲低后，NAT10蛋白水平。
2.NAT10加重H/R诱导的心肌细胞铁死亡
为了研究NAT10在心肌细胞凋亡中的功能，本研究在体外进行了功能获得和功能丧失实验。分离新生小鼠心肌细胞并进行缺氧氧合（H/R）。携带NAT10基因的腺病毒转染心肌细胞，无论是否存在H/R暴露，都会导致NAT10 mRNA和蛋白水平升高。无论是否存在H/R暴露，NAT10的过表达都会降低细胞活力（图2 A）。NAT10过表达导致脂质ROS水平显著升高，GPX4蛋白水平显著降低（图2 B-D）。相反，siRNA介导的NAT10敲低明显消除了H/R诱导的NAT10表达上调，这种下调导致细胞活力增加（图2 E）。此外，NAT10的下调减弱了H/R诱导的心肌细胞脂质ROS水平的升高和GPX4蛋白水平的降低（图2 F-H）。这些结果显示NAT10参与心肌细胞铁死亡。
图2：NAT10加重H/R诱导的心肌细胞损伤
（A）用CCK8试剂盒检测NAT10过表达细胞活力；
（B）NAT10过表达后GPX4蛋白水平；
（C-D）NAT10过表达后C11 BODIPY荧光染色分析脂质-ROS（红色：非氧化形式的C11 BODIPY；绿色：C11 BODIPY的氧化形式）；
（E）用CCK8试剂盒检测NAT10敲低细胞活力；
（F）NAT10敲低后GPX4蛋白水平。
（G-H）NAT10敲低后C11 BODIPY荧光染色分析脂质-ROS（红色：非氧化形式的C11 BODIPY；绿色：C11 BODIPY的氧化形式）。
3.缺乏NAT10可预防I/R诱导的心肌铁死亡
为了研究NAT10在I/R损伤时心肌铁死亡中的潜在作用，本研究将NAT10f/+（以下称为NAT10f/+）小鼠与Myh6-Cre小鼠杂交，建立心肌细胞特异性NAT10敲除小鼠（NAT10f/+/Myh6−Cre，以下称为NAT10CKO）。
WB结果证实，与NAT10f/+同窝对照相比，NAT10CKO小鼠心脏组织和分离的成年心肌细胞中NAT10蛋白表达明显下调。然而，在非心肌细胞中，NAT10蛋白的表达没有变化。随后对NAT10CKO和NAT10f/+小鼠进行心脏I/R手术。I/R后，NAT10f/+小鼠血浆乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶同工酶-MB（CKMB）水平升高；然而，这些影响在NAT10CKO小鼠中显著减弱（图3 A-B）。Evans蓝染色和三苯四唑氯染色结果显示，与NAT10f/+小鼠相比，NAT10CKO小鼠I/R后梗死面积减小（图3 C）。
此外，对NAT10f/+小鼠的超声心动图分析显示，I/R诱导的心脏射血分数（EF%）和缩短分数（FS%）明显降低，而这些变化在NAT10CKO小鼠中基本逆转（图3 D）。此外，I/R诱导的凋亡相关标记物GPX4在NAT10CKO小鼠中的下降明显高于NAT10f/+小鼠（图3 E）。与以往研究结果相似，透射电镜显示I/R小鼠心肌细胞的形态学特征表现为：线粒体扭曲，线粒体膜密度增加，线粒体大小减小。然而，令人惊奇的是，这些影响被NAT10敲低减轻了（图3 F-G）。此外，在I/R暴露的心脏中缺乏NAT10显著降低了脂质过氧化水平(图3 F；图3 H)。为了进一步证实操纵NAT10表达的治疗潜力，本研究构建了AAV9-shNAT10构建体来敲除小鼠心脏中的NAT10。正如预期的那样，与AAV9-shNC处理的小鼠相比，在I/R暴露的小鼠心脏中，NAT10的下调显著改善了心脏功能并抑制了心肌细胞铁死亡。这些结果表明，NAT10缺乏通过抑制心肌铁死亡来减轻心脏I/R损伤。
图3：缺乏NAT10可预防I/R诱导的心脏损伤
（A）LDH检测试剂盒检测血浆LDH；
（B）Elisa法测定血浆CKMB水平；
（C）Evans蓝/TTC双染I/R心肌梗死面积（IF：梗死面积；AAR：危险区域；LV：左心室）；
（D）超声心动图的代表性图像和射血分数（EF）、分数缩短（FS）的统计；
（E）GPX4蛋白水平；
（F）小鼠心脏组织透射电镜图及缺血再灌注损伤后24 h小鼠心脏组织4-HNE免疫组化染色；
（G）Flameng评分评估小鼠心脏组织线粒体损伤程度；
（H）脂质过氧化测定试剂盒检测组织脂质过氧化水平。
4.NAT10诱导心肌铁死亡加重心脏I/R损伤
为了进一步研究NAT10在体内心肌细胞铁死亡中的作用，本研究通过尾静脉注射传递编码NAT10的AAV9载体（AAV9-NAT10），诱导心肌细胞特异性过表达NAT10。通过WB验证了NAT10在假手术和I/R暴露小鼠心脏中的成功过表达。与NAT10CKO小鼠的研究结果相反，在没有I/R的情况下，单独过表达NAT10足以增加血浆中LDH和CKMB的水平，并且NAT10过表达促进了I/R后这些酶的释放（图4 A-B）。I/R诱导的心肌梗死面积增加通过NAT10过表达进一步增强（图4 C）。如心功能损伤所示，I/R诱导的有害影响因NAT10过表达而进一步加剧（图4 D-E）。透射电镜分析显示，NAT10的过表达足以在基线时引起线粒体破坏，如线粒体膜密度增加和线粒体大小减小所示（图4 F-G）。同时，I/R后亦观察到NAT10过表达加剧了线粒体损伤（图4 F-G）。此外，NAT10过表达提高了小鼠心脏中GPX4蛋白水平和脂质过氧化水平（图4 H-I）。为了进一步证实NAT10在I/R时触发心脏铁死亡的主导作用，本研究在I/R诱导前腹腔注射Fer-1（铁死亡抑制剂）或Emricasan（细胞凋亡抑制剂）。正如预期的那样，Fer-1或Emricasan治疗显著抑制CKMB和LDH释放，减少心肌梗死面积，减轻I/R暴露心脏中NAT10诱导的心功能障碍（图4 J-M）。更重要的是，根据上述参数，Fer-1治疗的心脏保护作用远优于Emricasan治疗。与体内实验结果一致，Fer-1处理减轻了NAT10过表达诱导的培养心肌细胞铁死亡，恢复了细胞活力的丧失。这些结果表明，NAT10诱导的铁死亡在I/R损伤中起着更为重要的作用。
图4：NAT10加重心脏I/R损伤
（A）LDH检测试剂盒检测血浆LDH；
（B）Elisa法检测血浆CKMB水平；
（C）Evans蓝/TTC双染法检测I/R心肌梗死面积（IF：梗死面积；AAR：危险区域；LV：左心室；
（D-E）超声心动图代表性图像及射血分数（EF）、缩短分数（FS）统计；
（F）小鼠心脏组织透射电镜图及I/R后24 h小鼠心脏组织4-HNE免疫组化染色；
（G）Flameng评分评估小鼠心脏组织线粒体损伤程度；
（H）脂质过氧化测定试剂盒检测组织脂质过氧化水平；
（J）采用肌酸激酶同工酶MB测定试剂盒分析血浆CKMB水平；
（K）乳酸脱氢酶测定试剂盒检测血浆LDH活性；
（L）TTC染色I/R心肌梗死面积（标尺：2mm）；
（M）超声心动图的代表性图像及射血分数（EF）、分数缩短（FS）的统计。
5.NAT10通过ac4C修饰增强了Mybbp1a的稳定性
为了探索NAT10在I/R期间加剧心肌细胞铁死亡的分子机制，本研究进行了RNA乙酰化测序（ac4C acRIP-seq）&RNA-seq。与ac4C修饰增强mRNA稳定性的发现一致，本研究的研究结果显示，相对于假手术对照心脏，在I/R暴露的心脏中，1481个超上调基因的2342个ac4C峰增加（称为高乙酰化ac4C峰），而1109个超下调基因的1326个ac4C峰减少（称为低乙酰化ac4C峰）（图5 A）。对与生物过程和分子功能相关基因的基因本体（GO）富集分析显示，在I/R暴露的心脏中，ac4C高乙酰化的基因主要与生物过程、细胞过程和蛋白质结合的调控有关。为了筛选NAT10的潜在靶点，本研究首先对小鼠心脏中涉及细胞死亡的差异乙酰化基因进行了qPCR检测，在12个基因中，Mybbp1a、Ddx21和Pabpc1在I/R暴露的心脏中显著上调，但在NAT10被敲低后下调（图5 B-C）。为了进一步验证ac4C acRIP-seq结果，本研究对心肌细胞中ac4c乙酰化基因进行了acRIP-qPCR检测（图5 D）。结果所示，相对于抗IgG片段，Mybpp1a在抗NAT10免疫沉淀片段中显著富集，并且NAT10过表达进一步增强了这种富集（图5 D）。由于NAT10增加了Mybbp1a mRNA和蛋白水平，本研究在心肌细胞中进行了放线jun素D处理的RNA衰变实验，结果表明，过表达NAT10可以阻止放线jun素D诱导的Mybb1pa mRNA降解（图5 E-F）。此外，本研究发现Mybpp1a蛋白水平在I/R暴露的心脏中显著升高，而这种变化被NAT10缺乏所消除（图5 G）。相反，在I/R处理存在或不存在的情况下，NAT10的过表达增加了Mybbp1a蛋白的表达（图5 H）。与这些发现一致，NAT10的敲低逆转了H/R诱导的Mybbp1a蛋白在体外心肌细胞中的表达增加。此外，无论是否存在H/R处理，NAT10的过表达都增加了Mybbp1a蛋白水平。这些结果表明，Mybbp1a可能在心脏I/R损伤期间作为NAT10的下游靶点。与AAV9-shNC相比，Mybbp1a敲低可显著降低I/R暴露的梗死面积和血浆LDH和CKMB水平（图5 I-K）。此外，敲低Mybbp1a可显著改善I/R诱导的心功能障碍（图5 L）。值得注意的是，通过敲低Mybbp1a可减轻I/R诱导的心脏铁死亡，如GPX4水平升高和脂质过氧化水平降低所示（图5 M-O）。这些结果表明，敲低Mybbp1a通过减轻心肌细胞铁死亡来保护I/R诱导的心脏损伤。
图5：NAT10通过诱导其ac4C修饰来稳定Mybbp1a
（A）与Sham相比，I/R处理小鼠心脏mRNA水平和ac4C水平变化的相关性；
（B）I/R中ac4C靶mRNA水平；
（C）I/R后AAV9-shNAT10处理心脏ac4C靶mRNA水平；
（D）用acRIP-qPCR检测Mybbp1a mRNA的ac4C修饰水平
（E）放线jun素D处理的心肌细胞中Mybbp1a mRNA的降解；
（F）Adv-NAT10处理心肌细胞Mybbp1a mRNA水平；
（G-H）I/R心脏Mybbp1a蛋白水平；
（I）LDH检测试剂盒检测血浆LDH；
（J）Elisa法分析血浆CKMB水平；
（K）Evans蓝/TTC双染I/R心肌梗死面积（IF：梗死面积；AAR：危险区域；LV：左心室）；
（L）超声心动图代表性图像及射血分数（EF）、缩短分数（FS）统计；
（M）脂质过氧化测定试剂盒检测组织脂质过氧化水平；
（N）心肌再灌注损伤后24 h小鼠心脏组织4-HNE免疫组化染色；
（O）GPX4蛋白水平。
6.NAT10通过调节Mybbp1a/p53轴加重心脏I/R损伤
考虑到Mybbp1a敲低对心脏I/R损伤的保护作用以及NAT10介导的Mybbp1a的稳定，本研究假设Mybbp1a可能介导NAT10在心脏铁死亡和I/R损伤中的有害作用。为了验证这一假设，本研究通过尾静脉注射AAV9-shMybbp1a到NAT10-过表达的小鼠心脏中来敲除Mybbp1a。正如预期的那样，Mybbp1a的敲低减少了I/R暴露的NAT10过表达心脏中LDH和CKMB的释放（图6 A-B）。此外，与AAV9-shNC处理组相比，Mybbp1a敲低可显著改善I/R暴露的NAT10过表达心脏的心功能（图6 C-D）。此外，通过敲低Mybbp1a，可以消除I/R后NAT10对心脏铁死亡的有害影响，如GPX4蛋白水平升高和脂质过氧化水平降低所示（图6 E-G）。与体内结果一致，敲低Mybbp1a消除了NAT10诱导的H/R暴露心肌细胞。有报道称，Mybbp1a在细胞应激时通过募集P300增强p53乙酰化和转录激活，从而诱导细胞死亡。因此，本研究假设NAT10诱导的p53激活是由于Mybbp1a/ p300介导的p53乙酰化。然后本研究进行了共免疫沉淀试验来验证这一假设。结果显示，I/R增加了P300和p53之间的相互作用，而这种相互作用在AAV9-shNAT10小鼠中被明显消除（图6 H）。此外，NAT10过表达增强了P300与p53的结合，而这种相互作用被Mybbp1a敲低抑制（图6 I）。已有研究表明，乙酰化的p53通过抑制SLC7A11的转录表达，抑制胱氨酸的摄取，并使细胞对铁死亡敏感。因此，本研究通过ChIP实验来确定NAT10/Mybbp1轴对p53与SLC7A11基因启动子区相互作用的影响。正如预期的那样，在H/R暴露的心肌细胞中，NAT10的过表达促进了p53与SLC7A11启动子的结合，而沉默Mybbp1a逆转了这种作用（图6 J）。这些结果表明，NAT10对心脏I/R损伤的有害作用是由Mybbp1a/p53轴介导的。
图6：Mybbp1a介导NAT10诱导的心脏I/R损伤加重。
（A）LDH检测试剂盒检测血浆LDH；
（B）Elisa法分析血浆CKMB水平；
（C-D）超声心动图代表图像及射血分数（EF）和分数缩短（FS）统计；
（E）心肌再灌注损伤后24 h小鼠心脏组织4-HNE免疫组化染色；
（F）脂质过氧化测定试剂盒检测组织脂质过氧化水平；
（G）GPX4蛋白水平；
（H-I）用抗p300抗体或对照IgG免疫沉淀小鼠缺血组织的蛋白裂解物，然后用10% SDS-PAGE分离。用抗p300或p53抗体对转移膜进行免疫印迹；
（J）p53结合SLC7A11启动子的ChIP分析（用NAT10腺病毒和siMybbp1a处理心肌细胞，并在指定时间进行H/R）。
7.重塑蛋白可减轻心脏I/R损伤
以上结果表明NAT10是治疗I/R的潜在靶点。为了进一步验证这一假设，我们用一种NAT10的小分子抑制剂——重塑蛋白（Remodelingin）预处理小鼠，研究其是否能改善心脏I/R损伤。正如预期的那样，口服重塑蛋白显著降低了I/R诱导的NAT10 mRNA和蛋白质表达的增加。然而，在生理状态下，重塑并不能改变心肌细胞中NAT10的mRNA和蛋白水平。值得注意的是，与药物处理的小鼠相比，经I/R处理的小鼠心肌梗死面积减小（图7 A）。I/R暴露心脏诱导的LDH和CKMB释放被重塑蛋白明显抑制（图7 B-C）。超声心动图分析显示，与载药治疗相比，重塑蛋白治疗后I/R诱导的心功能障碍得到了极大的改善（图7 D）。在分子水平上，重塑蛋白抑制了I/R诱导的p53和Ac-k379-p53蛋白表达上调（图7 E-F）。此外，重塑蛋白治疗抑制了I/R诱导的心脏铁死亡，如心脏脂质过氧化积累的减少以及GPX4和SLC7A11蛋白表达的增加（图7 G-I）。结果表明，重塑蛋白可减轻心肌铁死亡和I/R损伤。
图7：重塑蛋白可减轻心脏I/R损伤
（A）Evans蓝/TTC双染I/R心肌梗死面积（IF：梗死面积；AAR：危险区域；LV：左心室）；
（B）LDH检测试剂盒检测血浆LDH；
（C）Elisa法分析血浆CKMB水平；
（D）代表性超声心动图及射血分数（EF）、缩短分数（FS）统计；
（E）P53蛋白水平；
（G）心肌再灌注损伤后24 h小鼠心脏组织4-HNE免疫组化染色；
（H）脂质过氧化测定试剂盒检测组织脂质过氧化水平；
（I）GPX4蛋白水平。

全文小节

· NAT10在I/R损伤后的心肌细胞中表达水平升高，并且p53可以作为转录激活因子上调NAT10的表达。
· NAT10通过催化N4-乙酰胞嘧啶（ac4C）修饰，增强了Mybbp1a mRNA的稳定性，从而增加了Mybbp1a蛋白的表达。
· Mybbp1a的增加进一步激活了p53，导致抗铁死亡基因SLC7A11的转录受到抑制，进而促进了心肌细胞的铁死亡
· NAT10的小分子抑制剂Remodelin可以减轻心脏I/R损伤，表明NAT10是一个潜在的治疗靶点。
 

云序生物RNA修饰优势

 

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