circRNAs正在成为心脏发育和疾病强有力的调节因子，但其在心脏再生中的作用仍然未知。鉴于此，作者与他的团队探究了与超增强子(SEs)相关的circRNA-Nfix在小鼠心肌梗死后再生过程中的功能，并探究了其调节心脏重塑的分子机制，并于2019年4月5日，将该成果发表在了circulation杂志（IF=18.88）中。在本研究中，作者首先利用生物信息学分析RNA测序数据并结合SE目录，识别与SE相关的circRNAs，并利用qPCR和原位杂交技术检测发现发现circNfix在人类、大鼠和小鼠的成年心脏中过表达。然后通过在心肌梗死(MI)后心肌细胞(CM)中干扰或过表达circNfix，探究其对细胞增殖和心肌修复过程中的作用，并发现下调circNfix能够促进心肌梗死后CM增殖和血管生成，并抑制CM凋亡，减轻心功能障碍，改善预后效果。最后作者利用染色质免疫沉淀法(ChIP)和电泳迁移率转移法(EMSAs)方法测定转录因子Meis1与能够与circ-nfix的SE结合；利用RNA pull-down和荧光素酶报告基因分析方法研究circRNA与蛋白质或与miRNA的相互作用；发现下调circNfix能够增强Ybx1与Nedd4l (E3泛素连接酶)的相互作用，并诱导Ybx1发生泛素化降解，抑制下游cyclin-A2和cyclin-B1的表达。此外, circNfix还作为ceRNA，吸附mir-214并促进Gsk3β表达和抑制β-catenin活性。即：SE调控的circNfix缺失通过抑制Ybx1泛素依赖降解，增加miR-214活性，促进心肌梗死后心脏再生修复和功能恢复，可能是改善心肌梗死预后的一个有前景的策略。
技术路线
（1）转录因子Meis1通过结合Nfix位点的SE驱动circNfix表达：H3k27ac、H3k4me1和H3k27me3在人心脏组织Nfix位点的ChIP-seq谱（云序生物提供该服务）（A）。H3k27ac、H3k4me1、H3k27me3、P300、DNA超敏(DHS)、Meis1及PhastCons在小鼠心脏组织Nfix位点的保守性评分，以及小鼠CMs中H3k27ac ChIP-seq（云序生物提供该服务）（B）。SE与circNfix启动子区looping事件的3C-qPCR分析（C）。四种成分增强子(E1、E2、E3、E4)构建的pgl3启动子报告载体荧光素酶检测（D）。Meis1沉默后P7 CMs中野生型E2和突变E2的荧光素酶活性（E）。circNfix-SE中孵育Meis1结合位点被DIG-ddUTP标记寡核苷酸探针后，P7 CMs中提取的核蛋白的EMSA结果（F）。ChIP-qPCR（云序生物提供该服务）检测显示Meis1结合位点在circNfix-SE中扩增（G）。QRT-PCR检测Meis1基因敲除后P7 CMs中circNfix和Nfix mRNA的表达水平（H）。RNA FISH 检测Meis1基因敲除后P7 CMs中circNfix的亚细胞定位（I）。EdU染色检测Meis1和circNfix干扰后对P7 CMs增殖的影响（J）。
（2）CircNfix与Ybx1结合并促进其降解：circNfix和对照组的蛋白质谱分析（A）。采用Ybx1、Nedd4l或阴性IgG抗体进行RIP实验（云序生物提供该服务）（B）。P0 CMs中过表达circNfix后Ybx1蛋白表达水平（C-D）。qRT-PCR检测P0 CMs中Ybx1 mRNA表达水平（E）。RNA FISH在P0 CMs中过表达和不表达circNfix时， circNfix和Ybx1的亚细胞共定位（F）。分馏实验表明，circNfix过表达促进了Ybx1在细胞质中的易位，增加了Ybx1在细胞质中的降解（G）。在circNfix和Ybx1干扰后，细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白B1的表达水平（H）。ChIP-qPCR（云序生物提供该服务）检测显示，cyclin A2和cyclin B1启动子中Ybx1结合位点扩增（I）。细胞裂解物用抗Ybx1抗体免疫沉淀，用泛素(Ub)特异性抗体、抗Ybx1抗体或抗nedd4l抗体免疫印迹分析进行WB分析。过表达circNfix的CMs中Ybx1蛋白表达水平（K-L）。
（3）circNfix与miR-214的相互作用：预测miR-214和miR-761能够与circNfix结合（A）。成年小鼠心脏中下调circNfix后，miR-214和miR-761的表达（B）。双荧光报告实验检测miR-214和circNfix能够直接结合（C）。RNA pull-down（云序生物提供该服务）实验检测circNfix能够拉下miR-214（D）。RNA FISH实验检测P0 CMs中，miR-124和circNfix能够共定位在胞质中（E）。RNA FISH实验检测P0 CMs中，miR-124和Gsk3β能够共定位在胞质中（F）。双荧光报告实验检测miR-214和Gsk3β 3’UTR直接结合（G）。WB检测干扰circNfix后Gsk3β蛋白的表达水平（H）。WB检测干扰或过表达miR-124后Gsk3β蛋白的表达水平（I）。WB检测干扰circNfix和miR-214后Gsk3β蛋白的表达水平（J）。CMs中，干扰circNfix后β-catenin的表达水平（K）。CMs中，干扰Meis1后Meis1和 Gsk3β的表达水平（L）。CMs中，干扰Meis1和circNfix后GSK3β的表达水平（M）。干扰circNfix, Ybx1, miR-214 和 Gsk3β后，P7 CMs进行pH3 和 Aurora B免疫染色（N）。
https://www.ahajournals.org/doi/pdf/10.1161/CIRCULATIONAHA.118.038361
环状RNA测序
RNA pull down
RIP测序
ChIP测序
m6A RNA全转录组甲基化测序
m6A RNA 环状RNA测序
m5C RNA全转录组甲基化测序
m5C RNA 环状RNA测序
m1A RNA全转录组甲基化测序
m1A RNA 环状RNA测序
超微量环状RNA甲基化测序
1.Whole-genome and Transcriptome Sequencing of Prostate Cancer Identify New Genetic Alterations Driving Disease Progression
2.SUMOylation of the m6A-RNA methyltransferase METTL3 modulates its function
3.CircHLA-C Plays an Important Role in Lupus Nephritis by Sponging miR-150
4.Identification of Circular RNAs and Their Targets in Leaves of Triticum aestivum L. under Dehydration Stress
5.Circular RNA alterations are involved in resistance to avian leukosis virus subgroup-J-induced tumor formation in chickens
6.Identification of circular RNAs and their alterations involved in developing male Xenopus laevis chronically exposed to atrazine
7.Identification and characterization of circular RNAs in zebrafish
8.Differential Expression of Circular RNAs in Glioblastoma Multiforme and Its Correlationwith Prognosis
9.Circular RNA Signature Predicts Gemcitabine Resistance of Pancreatic Ductal Adenocarcino
10.Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition
11.RNA-Seq profiling of circular RNAs in human colorectal Cancer liver metastasis and the potential biomarkers
12.Analysis of changes to lncRNAs and their target mRNAs in murine jejunum after radiation treatment
13.circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice
Shanghai Cloud-seq Biotech Co., Ltd.
地址：上海市松江区莘砖公路518号20号楼3楼
电话：021-64878766
传真：021-64878766
网址：www.cloud-seq.com.cn
上海云序生物科技有限公司 商家主页
地 址： 上海市松江区莘砖公路518号24号楼4楼
联系人： 戴小姐
电 话： 021-64878766
传 真： 021-64878766
Email：market@cloud-seq.com.cn;liuqingqing@cloud-seq.com.cn
相关咨询
杨宝峰院士团队RNA修饰又一成果 | 云序ac4C acRIP-seq助力揭示心脏I/R损伤的作用机制 (2024-12-03T00:00 浏览数:1488)
杨宝峰院士团队最新成果 | 云序助力揭示RNA修饰m7G调控心肌肥厚的机制研究 (2024-11-13T00:00 浏览数:3083)
Nature子刊| 重磅综述！一文总结「m6A修饰非编码RNAs」在各类肿瘤中的调控机制及作用 (暂无发布时间 浏览数:3106)
研究速览-eccDNA 2023年最新进展大放送！ (暂无发布时间 浏览数:2853)
云序生物MeRIP-qPCR技术干货 (暂无发布时间 浏览数:2820)
技术干货| “eccDNA碱基序列的获取及引物设计”方法教程 (暂无发布时间 浏览数:3181)
云序客户m6A高分文章|揭示组蛋白乙酰化与m6A修饰在眼部黑色素瘤发生中的共同作用机制 (暂无发布时间 浏览数:2520)
Nat Biotechnol IF=47 | BID-seq:一种基于单碱基分辨率的假尿嘧啶（Ψ）修饰定量测序检测方法 (暂无发布时间 浏览数:2257)
北大伊成器团队Nature Reviews重磅发文：非m6A热门修饰调控与功能一文速览！ (暂无发布时间 浏览数:2897)
用户文章m6A专题|IF=9.8|m6A去甲基化酶ALKBH5缺乏会加重钴致神经退行性损伤 (暂无发布时间 浏览数:2136)